Testy genetyczne na SARS-CoV-2

Metoda RT-LAMP a RT-PCR

Porównanie technik RT-LAMP i RT-PCR

 

 

 

RT-LAMP

RT-PCR

Reakcja odwrotnej transkrypcji
Tak, z jednoczesną reakcją amplifikacji cDNA
Tak, osobny etap temperaturowy dla reakcji amplifikacji
Startery/sondy
Wykorzystuje 5 starterów hybrydyzujących dla genu N oraz 6 starterów hybrydyzujących dla genu S , które przyłączają się do 7-8 miejsc w analizowanych sekwencjach. Dzięki temu spada prawdopodobieństwo powielenia, innego niż docelowy, fragmentu materiału genetycznego
Wykorzystuje parę starterów hybrydyzujących, która przyłącza się do jednego miejsca w analizowanej sekwencji, oraz jedną sondę molekularną hybrydyzującą, która przyłącza się do fragmentu cDNA, znajdującego się pomiędzy dwoma starterami
Denaturacja termiczna
Etap denaturacji termicznej  został wyeliminowany, dzięki zdolności polimerazy Bst do przemieszczania nici DNA
Nici DNA muszą zostać rozdzielone, żeby startery i sondy mogły się przyłączyć do miejsc docelowych
Czas trwania procesu
Proces zachodzi w stałej temperaturze 64°C, a protokół amplifikacji kwasu nukleinowego trwa 30 minut
  • Proces zwykle składa się z trzech etapów. powtarzających się cyklicznie około 40 razy: denaturacja (95°C), przyłączanie (50-60°C), wydłużanie (72°C)
  • Etapy te są poprzedzone reakcją odwrotnej transkrypcji trwającą od 10 do 30 minut. Cały proces analizy, w zależności od badanego materiału oraz użytych odczynników, trwa od 1,5 do 3 godzin
Czułość
Pozwala wykryć materiał genetyczny w ilości 10(-15) g
Pozwala wykryć materiał genetyczny w ilości 10(-9) g
Niezbędny sprzęt
Termocykler czasu rzeczywistego
Termocykler czasu rzeczywistego
Kanał odczytu fluorescencji
  • Odczyt badanych genów wirusa (N oraz S) w jednym kanale FAM/SYBR Green (zielony)
  • Kontrola wewnętrzna (IC) genu ludzkiego dla próbki badanej, zlokalizowana jest w osobnym tzw. dołku - odczyt także w kanale FAM/SYBR Green (zielony)
Występuje wiele kanałów odczytu sygnału fluorescencji dla analizowanych genów w wyniku hybrydyzacji z sondami znakowanymi różnymi barwnikami
Możliwość  rozróżnienia, który gen odpowiada za pozytywny wynik reakcji
Na zasadach analizy krzywych topnienia produktu amplifikacji dla analizowanych sekwencji genów N i S
Reakcja dla poszczególnych genów odczytywana jest w osobnych kanałach odczytu fluorescencji

 

Na podstawie: Dhama K., Karthik K., Chakraborty S., Tiwari R., Kapoor S., Kumar A., Thomas P: Loop-mediated isothermal amplification of DNA (LAMP): a new diagnostic tool lights the world of diagnosis of animal and human pathogens: a review. Pak. J. Biol. Sci. 2014, 17, 151-166.